Recuperación funcional en un modelo de ratón de Ataxia de Friedreich por transferencia del gen Frataxin con un vector HSV-1 Amplicon.


Filip Lim (1), Gloria M. Palomo (1), Christina Mauritz (1), Alfredo Giménez-Cassina (1), Belen Illana (1), Francisco Wandosell (1), y Javier Díaz-Nido (1). 1) Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), Universidad Atónoma de Madrid, Madrid, España.


Traducción de Miguel-A. Cibrián.


NOTA: Se advierte que en esta traducción al español, para no cometer errores debidos a la falta de formación del traductor, han sido elimadas algunas partes, puramente técnicas. Por ello, este texto sólo puede servir como información básica. Para información profunda, véase el documento original, en inglés: click aquí >


Actualmente, no hay tratamiento eficaz para la ataxia de Friedreich (FA), la más corriente en el campo de las ataxias hereditarias. La enfermedad es causada por mutaciones en FRDA que reducen drásticamente los niveles de expresión de la proteína mitocondrial frataxina. En los modelos animales del FA, la mayor dificultad reside en obtener niveles adecuados de expresión de la frataxina en los tejidos apropiados para provocar la patología sin causar mortalidad temprana. Para desarrollar estrategias, evitando estos problemas, se ha generado ratones condicionales transgénicos de frataxina. Ahora mostramos que la expresión de la frataxina CRE-expresión con vectores del virus de herpes tipo 1 (HSV-1) amplicon simplex. También hemos logrado la entrega, in vivo, por inyección estereotáxica de estos vectores CRE-expresión en el tronco cerebral de ratones loxP[frda] para generar un modelo knockout de gen localizado. Estos ratones desarrollan un déficit conductual en el análisis con rotarod perceptible tras cuatro semanas, y cuando son inyectados con vectores amplicon HSV-1, que expresan la frataxina humana ADN complementaria (cDNA), exhiben recuperación conductual a las cuatro semanas después de la segunda inyección. A nuestro entender, ésta es la primera prueba inicial de recuperación de la función neurológica por agente terapéutico dirigido a corregir la deficiencia de frataxina.


INTRODUCCIÓN

De modo similar a muchas otras enfermedades neurodegenerativas, la ataxia de Friedreich (FA), la más corriente de las ataxias hereditarias, aún no es curable, y las opciones de tratamiento son limitadas. Por ello, hay necesidad urgente de explorar nuevas estrategias terapéuticas, como la terapia génica. El descubrimiento de mutaciones en FRDA, el gen de la frataxina, causantes de FA (1) ha jugado un importante papel adelantando el conocimiento del mecanismo molecular de la enfermedad, y ha abierto un camino para tratamientos en vías de desarrollo, basados en el gen. La frataxina humana es una proteína de 210 aminácidos, aunque ha sido identificada una variante que codifica 196 aminoácidos, la cual difiere en forma desde el aminoácido 160 (2). En FA, la mutación patológica más corriente consiste en un triplete de expansión GAA dentro del primer intron de FRDA (1), que, en homocigotos, reduce la expresión del ARN mensajero a niveles sumamente bajos o indetectables. Algunos pacientes son heterocigotos para expansiones GAA, pero también tienen mutaciones de punto en el otro alelo FRDA (3-6). Generalmente, ahora es aceptado que FA es debida a pérdida de función de la frataxina (7), y como la introducción de trasgenes de frataxina en ratones normales no tienen ningún efecto nocivo en este desorden (8-10), el rescate del gen, es un buen modelo de terapia.


La neuropatología típica de FA (11) afecta a la raíz de ganglios dorsales, médula espinal, médula oblongada, y núcleo dentado del cerebelo, con atrofia significativa de los pedúnculos cerebelosos superiores. Los casos avanzados también son caracterizados por atrofia de las células de Purkinje en la corteza cerebelosa. Para la entrega del gen en el sistema nervioso, muestran gran potencial un número de vectores virales, tales como los derivados del tipo 1 del virus herpes simplex (HSV-1), el lentivirus, y virus adenoasociados (12). Un estudio, anterior a la demostración de la terapia génica en FA, dio a conocer la construcción de vectores víricos, lentivirus, y adenoasociados, que codifican la frataxina humana complementaria ADN (cDNA), y su capacidad para corregir parcialmente la sensibilidad de los fibroblastos de los pacientes de FA a la tensión oxidativa (13), y el uso de estos vectores aplicado al tejido fino neuronal. Aunque la transferencia génica experimentada con vectores virales lentiviral y adenoasociados está rindiendo resultados alentadores en otros sistemas neuronales, los vectores HSV-1 poseen varias características ventajosas: no están integrados en otros vectores, pueden acomodar grandes cantidades de ADN (hasta 150 kilobases), y además HSV-1 es neurotrófico, tienen infeciosidad alta en una amplia gama de tipos neuronales. Hemos utilizado, previamente, los vectores HSV-1 amplicon para manipulaciones genéticas en el sistema nervioso (14-15), y, particularmente, para la transferencia génica en la oliva inferior de ratas (16), un núcleo en la médula de papel clave en el motor de la coordinación (17). Para tratar con mayor rapidez los aspectos neurológicos de FA, en este estudio hemos utilizado vectores HSV-1 amplicon para entregar recombinasa CRE en el mismo área del cerebro de ratones transgénicos condicionales (floxed) de FRDA (de aquí en adelante nos referimos a ellos como ratones loxP[frda]) (18) que se pueden cuantificar fácilmente con pruebas tales como el rotarod (19). Usando el modelo que hemos seguido para realizar el rescate del gen con un vector HSV-1 amplicon para codificar cDNA frataxina humana, demuestra que la función neuronal por agotamiento de frataxina puede ser recuperada mediante terapia génica.


Figura 1: Caracterización del vector del virus tipo herpes tipo simplex  1 (HSV-1) amplicon. (a) La representación esquemática de los vectores que expresan ß-galactosidasa (pHSVlac: lacZ = flecha azul), ß-galactosidasa y CRE recombinasa (pHLC: lacZ = flecha azul, CRE = flecha verde), y la frataxina humana etiquetafa con la FLAG epitope en el C-término (pHF: frda = flecha roja, FLAG = rectángulo purpúreo). La Escherichia coli lacZ y los trasgenes del ADN frda humano complementario (cDNA) se expresan desde el promotor HSV1  IE4/5, y la CRE recombinasa se expresa desde el citomegalovirus promotor inmediato. Además a los elementos para la propagación en bacterias (no mostrados), cada amplicon plásmido contenía un HSV-1 origen de replicación oriS  (S), y el empaquetado señal "a" HSV-1. (b) La expresión del transgen fue observada siguiendo la transfectión de los plásmidos en las células de Vero. La expresión de ß-galactosidasa desde los plásmidos pHSVlac.


Alteración de los niveles de frataxina en neuronas murinas por vectores HSV-1 amplicon:

Para caracterizar la expresión del transgén a nivel bioquímico hemos infectado las neuronas corticales primarias del ratón con empaquetado de los vectores pHLC y pHF del HSV-1 amplicon (figura 2a y b). Usando tubulin y actin como controles para la cantidad de cargamento (figura 2a, segundo y tercer paneles), análisis wester blot de extractos de cultivos de células neuronales de ratones loxP[frda] infectados con el aumento de cantidades del vector pHLC han revelado incremento en las cantidades de β-galactosidasa y expresión de recombinasa CRE (figura 2a, primero y cuarto paneles). Las cantidades que disminuyen correlacionadas de frataxina en los mismos extractos (Figura 2a, panel inferior) indican que la recombinasa expresada CRE era claramente funcional y capaz de inactivar el gene frda en las neuronas infectadas suprimiendo el exon 4 floxed (véase la referencia 18, y figura 2c). Confirmamos después nuestra capacidad de aumentar la expresión de la frataxina usando el vector pHF (figura 2b). Al usar los cebadores detectamos la expresión del mensajero ARN de la frataxina humana en las neuronas infectadas con el vector pHF, pero no en los controles no infectados (Figura 2b, cuadro de arriba) o en las neuronas infectadas con pHSVlac (datos no mostrados). La infección del vector de cultivos neuronales no afectó a la expresión de la frataxina endógena del ratón (Figura 2b, segundo cuadro) con respecto al control del ARN mensajero fosfato glyceraldehido deshidrogenasa (Figura 2b, tercer cuadro). Usando tubulin como control para la cantidad a cargar (Figura 2b, cuarto cuadro), el análisis western blot de extractos de neuronas pHF-infectadas mostró que la cantidad total de frataxina fue incrementada en comparación con los extractos de control (Figura 2b, tablero del fondo). 


Figura 2: Análisis bioquímico de las ateraciones en frda y en frataxina provocaas por los vectores pHLC y pHF. (a) El análisis Western blot de neuronas corticales primarias de los ratones loxP[frda] infectaron con volúmenes crecientes (0–50 µl) de pHLC. Los extractos celulares fueon hechos 6 días después de la infección y los Western blot sondeados con anticuerpos anti ß-galactosidasa (ß-chica), ß-tubulin (tubulin), actin, recombinasa CRE (CRE), y frataxina (1,250 anticuerpos policlonales).


Mediante la eliminación frda CRE en el tronco cerebral de los ratones loxP[frda] se povoca el déficit de coordinación motora. En los pacientes de FA, además del cordón espinal, los cambios degenerativos son notados en el tronco cerebral y en el cerebelo. Intentando desarrollar un modelo animal con alta sensibilidad a efectos terapéuticos, razonamos que la modulación de un pequeño grupo de neuronas importantes por la administración focal de vectores virales en el cerebro, podría ser suficiente para provocar un fenotipo atáxico. A continuación hemos inyectado el vector pHLC en la médula de los ratones loxP[frda] y la función recombinasa CRE es confirmada, in vivo, por la cadena de reacción polimerasa (PCR) (Figura 2d) usando los cebadores específicos P3 y P5 para descubrir el alelo frda Δ anulado (Figura 2c): el producto específico PCR para el aleleo Δ podría descubrirse del ADN genómico del tronco cerebral del los ratones loxP[frda] inyectados con cualquier concentración baja (Figura 2d, divisiones 2 y 3) o alta (Figura 2d, división 4) del vector pHLC, pero no desde el ADN genómico de los inyectados con pHSVlac (Figura 2d, división 1). Puesto que el ADN genómico se preparó a partir de una muestra de tallo cerebral incluyendo el sitio de inyección, se podría esperar que la proporción de células pHLC-infectadas en la masa total disectada de tejido fuera bastante baja. De hecho, el producto específico PCR por el no anulado alelo L3 (Figura 2d, tablero de arriba) era claramente perceptible, y no mostró ningún cambio usando pHLC a dosis bajas (Figura 2d, divisones 2 y 3) o altas (Figura 2d, división 4), como la mayoría de las neuronas en la muestra disectada no fue infectada por el vector viral.


En modelos de ratón, el aparato rotaroad es un método bien establecido para medir la coordinación motora. Para examinar el efecto fenotípico de excision del gen frda, medimos la actuación en el rotarod antes del tratamiento con los vectores virales y, después, a intervalos de dos semanas tras la inyección de vectores pHLC y pHSVlac (Figura 3) en los ratones (n = 3) loxP[frda] y ratones tipo natural C57/BL6 (n = 4). Después de 4 y 6 semanas, la separación entre los valores medios de los ratones loxP[frda, inyectados con pHLC, y los inyectados con pHSVlac, podrían observarse (Figura 3, fila de arriba), aunque las diferencias entre estos grupos no alcanzaron significancia real (P = 0.057 en ambos casos). Después de 8 semanas la diferencia de actuación en el rotarod entre los dos grupos era significativa (P = 0.03). Este défticit de coordinación motora era claramente debido a la excisión del gen frda, tal como no se observó la diferencia entre los dos vectores cuando se inyectaron en los ratones de tipo natural C57/BL6 (Figura 3, segunda fila).


Figura 3: Disminución de actuación en el rotarod de los ratones loxP [frda] inyectados con el vector pHLC. Los ratones fueron analizados en la prueba de aceleración del rotarod antes del tratamiento (semana 0) y en dos intervalos de semana después de la inyección estereotáxica en el tronco cerebral de 3 µl conteniendo el vector del pHSVlac.
El déficit de coordinación motora provocado por la excision del gen frda puede ser invertido por la entrega de cDNA frda. Puesto que un empeoramiento en la actuación en el rotarod pudiera notarse ya en 4 semanas tras la inyección expresando el vector CRE en los ratones loxP[frda], nuestra próxima investigación fue si este déficit motor pudiera revertirse mediante la entrega del gen frda con el vector pHF 4 semanas después de la excisión del gen frda (Figura 4). Comparamos cuatro grupos de ratones: los inyectados inicialmente con pHLC y luego con pHF (grupo "liberado", n = 6, círculos con líneas punteadas); los inyectados inicialmente con pHLC y luego con pHSVlac.. Notablemente, 4 semanas después de la segunda inyección (semana 8) los valores medios del grupo liberado habían revertido a los del grupo que simulaba lesión, y estaban aparte de los valores medios del grupo lesionado (Figura 4). Los valores medios del grupo que simulaba estar liberado eran indistinguibles de los del grupo lesionado, indicando que el segundo evento de inyección no tenía el efecto rescate no específico. Este modelo de diferencias entre los cuatro grupos se mantuvo a lo largo del resto del experimento (12 semanas después de la segunda inyección, semana 16), con diferencias significativas que se observan entre ratones liberados lesionados (P = 0.03) a la última medida (Figura 4). Estos resultados indican que el defecto neurológico provocado por la eliminación del gen frda en el tronco cerebral/cerbelo puede ser reversible reexpresando frda a un punto retrasado. En este estudio el retraso entre la lesión y rescate era de 1 mes, el periodo mínimo exigido para observar una disminución en la actuación en el rotarod.

Figura 4: Recuperación de actuación en el rotarod en CRE-lesionada en los ratones loxP[frda] inyectados con el vector pHF. Los ratones fueron analizados en las pruebas de aceleración del rotarod antes del tratamiento (semana 0) y a intervalos de dos semanas después de la inyección estereotáxica en el tronco cerebral de 3 µl conteniendo, o bien el vector pHSVlac, o vector pHLC.
DISCUSIÓN:
En este estudio, nuestra meta principal era generar datos de prueba inicial para terapia del gen de la frataxina en el tratamiento de la neuropatologia Ataxia de Friedrich. Como modelos animales, hemos generado ratones knockout de frataxina localizada por objetivo la oliva inferior de ratones transgénicos loxP[frda] con vectores virales recombinasa CRE. La ventaja principal de nuestro modelo es que el cerebro del ratón adulto contiene sólo ~30,000 neuronas olivares (22, 23) y el análisis histológico de varios ratones mutantes atáxicos muestra déficit neuronal olivar entre 20 y 60 % (23-27). Así, nuestro modelo debe ser sensible a dosificación de vector relativamente baja, permitiendo al HSV-1 amplicon el uso de stocks no concentrados, a los cuales previmente hemos hallado la característica de exhibir toxicidad despreciable en este área (16). De hecho, nuestros resultados muestran que a estas concentraciones de vector, in vivo, pueden descubrirse cambios en la actuación motora antes que la expresión del transgén, la cual requiere un décuplo de concentraciones.
Esto solamente era debido al límite de sensibilidad de detección, puesto que hemos sido capaces de detectar la actividad CRE recombinasa, in vivo, incluso a concentraciones bajas de vector. Aquí usamos la excisión del gen frda en las neuronas olivares para provocar un déficit en la actuación en el rotarod que fue estable por un periodo de 4 meses tras el experimento. También mostramos la recuperación del déficit en la coordinación motora por la restauración de la expresión de la frataxina usando un vector HSV-1 amplicon. Esta recuperación funcional era sorprendentemente completa, en vista del hecho de que la restauración de la frataxina sólo puede ocurrir en el subconjunto solapado de neuronas transducidas por ambas: primeras y segundas inyecciones. Son posibles varias explicaciones. Primero, el rescate del gen frda de un subconjunto de neuronas puede ayudar a la supervivencia de otros, estimulando la generación de factores tróficos y/o conexiones. Segundo, resultados similares fueron obtenidos por Fernández et al. (28), quién usó un modelo de rata atáxica en la cual provocaron la ablación de más del 80 % de la oliva inferior con 3-acetylpyridine. En este estudio, de tratamiento insulina factor de crecimiento 1, se produjo la supervivencia de sólo 27 % de las neuronas olivares totales, pero, notablemente, fue observada una total recuperación funcional. Estos autores no sólo atribuyen la recuperación funcional al incremento de supervivencia neuronal, sino también al inducido crecimiento axonal. Tercero, cuando la recuperación de coordinación motora alcanza cierto umbral, otros mecanismos compensatorios de aprendizaje y/o función motora puede ser suficientes para lograr un nivel normal de actuación en las tareas dadas como la prueba del rotarod.

El nivel de proteína frataxina expresado por nuestro vector pHF era similar a los niveles endógenos observados en las neuronas tipo natural
(comparar las divisiones izquierda y derecha en cuadro del fondo de Figura 1d), indicando que habíamos obtenido fisológicamente niveles relevantes de expresión del transgén. Esto puede ser particularmente importante, por la sobrexpresión del alto nivel de frataxina por el lentiviral o bien se hubiera informado previamente de vectores virales adenoasociados como tóxicos en fibroblastos de pacientes de FA (13). Hemos demostrado rescate del fenotipo de fibroblastos de FA recientemente con toxicidad despreciable usando vectore HSV-1 amplicon llevando el locus entero FRDA (29) el cual resulta en niveles fisiológicos de expresión. También se conoce que la expresión de frataxina es reducida al ~40 % en asimptomáticos portadores humanos de la patogénica mutación FRFA (30), indicando el nivel alto de expresión de frataxina no es requerido para la recuperación terapéutica. En este trabajo, a pesar del hecho de que la expresión de los promotores virales se ha observado disminuir significativamente en las neuronas in vivo, hemos usado amboscitomegalovirus y promotores HSV-1 IE4/5 paea conducir la expresión del transgén por varias razones: primero, necesitamos sólo expresión transitoria de recombinasa CRE (conducido por el promotor del citomegalovirus) para efectuar la excisión frda en las neuronas loxP[frda]; segundo, en contraste con otras areas del cerebro (31), hemos observado previamente que en la oliva inferior y el cerebelo, la expresión a partir del promotor IE4/5 es estable por más de 40 días (16); tercero, para este estudio de prueba de concepto, los vectores amplicon simples se usaron por la facilidad de construcción. Nuestros estudios continuados se enfocan en el uso de nuestros vectores HSV-1 amplicon llevando el locus genómico FRDA entero (29) como la presencia de secuencias nativas reguladoras, incluyendo el promotor, mejorador, y elementos del silenciador, probablemente producirá la expresión fisiológica y estable. Todas las estrategias terapéuticas apuntaron a aliviar el neurodegeneration en el FA y muchas otras condiciones neurológicas han fallado hasta ahora, enfatizando la necesidad de explorar otras opciones como la terapia génica. La entrega del transgén al sistema nervioso no es tarea fácil; la introducción de vectores en el torrente sanguíneo generalmente es ineficaz para llegar a las neuronas, y la mayoría de los métodos pasa por la inyección directa en el tejido nervioso, el cual, a su vez, predominantemente produce transducción en el área cercana al sitio de inyección. HSV-1 es una herramienta prometedora para la terapia génica del sistema nervioso (32) por varias razones: naturalmente, las neuronas son los objetivos para infección, y puede transportarse a lo largo del sistema nervioso para establecer la persistencia durante toda la vida; el virión tiene una capacidad de empaquetamiento sumamente grande; y el genoma permanece episomal en las células infectadas, evitando así un riesgo de mutagénesis insercional. Aquí hemos descrito la validacion funcional de los vectores virales HSV-1  para la entrega en el tronco cerebral mediante inyección estereotáxica para lograr la delección del gen focal y liberar a neuronas que afectan a la coordinación motora. Durante la preparación de este artículo, se ha informado de un nuevo modelo knock-out fe ratón trasgénico que mimetiza más estrechamente la enfermedad humana puesto que tienen transgenes FRDA que llevan la patológica repetición de expansiones GAA (33). Estos modelos animales facilitarán altamente nuestros prolongados estudios que apuntan a identificar los medios para lograr la penetración conveniente de nuestros vectores terapéuticos en los objetivos neuronales adecuados en la Ataxia de Friedreich.


Mantenimiento de los ratones. Los ratones han sido cuidados por personal especializado en el animalario del Centro de Biología Molecular, con acceso restringido. El protocolo experimental fue aceptado por el Cuidado Animal Institucional y el Comité de Uso, en el Centro de Biología Molecular, y siguió El Decreto europeo 86/609/CEE y su modificación postreior 2003/65/CE llevada a cabo por la ley española 1201/2005. Se realizaron todos los esfuerzos encaminados a minimizar el sufrimiento y el número de animales usados.

Prueba rotarod para coordinación motora. La coordinación motora fue determinada en un aparato rotarod (Ugo Basile, Italia). Los animales fueron probados usando el rotador acelerando de 4 a 40 rpm. en 5 minutos, seguidos por 5 minutos a velocidad máxima. La latencia se definió como la duración en que los ratones pudieron mantener su equilibrio en la barra acelerada hasta caerse, y se grabó en cuatro ensayos consecutivos. Los cuatro ensayos se dirigieron en mañanas y tardes, en 2 días con un mínimo de 4 horas entre ensayos en los experimentos mostrados en la Figura 3. En los experimentos mostrados en la Figura 4, se dirigieron los ensayos en días consecutivos. Se anotaron ratones que aún estaban en la barra al final del ensayo con una latencia de 10 minutos. Una semana antes de la primera medida, los ratones recibieron una sesión de entrenamiento para familiarizarse con el procedimiento.


RECONOCIMIENTOS:

Este trabajo ha sido apoyado por concesiones de la Friedreich’s Ataxia Research Alliance, la Fundación Caixa, y los Ministerios españoles de Educación y Ciencia, y Sanidad. F.L. es contratado mrdiante una beca Ramón y Cajal del Ministerio español de Educación y Ciencia. G.M.P. y A.G. intervinieron por becas de Formación de Profesorado Universitario del Ministerio español de Educación y Ciencia. B.I. es becario de reincorporación de la Organización Euopea de Biología Molecular. Estamos agradecidos a Rachael Neve (Hospital McLean, Boston) por el antisuero anti-FLAG; a Fabio Rossi (Universidad British Columbia) por el plásmido pCI-cre; a Francesc Palau (Instituto de Biomedicina, Valencia), y a José González Castaño (Universidad Autónoma de Madrid) por el cDNA de frataxina; a Helene Puccio (Institut de Genetique et Biologie Moleculaire et Cellulaire, Illkrich, Francia) por el anticuerpo policlonal anti-frataxina y, junto a Michel Koenig (Institut de Genetique et Biologie Moleculaire et Cellulaire, Illkirch, Francia), y a Ignacio Torres (Instituto Cajal, Madrid), por los ratones Frda+/L3. En el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", de Madrid, agradecemos a Jesús Avila por su ayuda, a Jose J. Lucas por el préstamo del aparato rotarod, a Javier Palacín, a todo el personal del animalario, y al servicio de la microscopia.


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