14- BASE MOLECULAR DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH. Por el Dr. Massimo Pandolfo. Revista "Neurología" 2000; 15: 325-329; Art: 002193 (1 de octubre del 2000). Traducción Isabel Campo, Cristina Fernández, y Miguel-A. Cibrián.

NOTA: Este artículo es extremadamente técnico, lo cual ha añadido dificultades al paso de un idioma a otro. Se advierte que esta traducción pudiera contener errores únicamente imputables a los traductores. El artículo original del Dr. Massimo Pandolfo, en Inglés, está en la revista "Neurología" 2000; 15: 325-329; Art: 002193; pagina web: http://db.doyma.es/cgi-bin/wdbcgi.exe/doyma/mrevista.fulltext?pident=12176

En 1863, Nicholaus Friedreich, Profesor de medicina en Heidelberg, Alemania, describió una "atrofia degenerativa de las secciones posteriores del cordón espinal" que causaba ataxia progresiva, pérdida sensorial y debilidad muscular. La causa de la ataxia descrita por Friedreich fue un misterio durante más de 130 años. La investigación de la enfermedad tomó un nuevo impulso a finales de la década de 1970 y principios de los ochenta, cuando estudios llevados a cabo establecieron para ella un modelo de herencia autosómica recesiva (1 - 3) y se definió un riguroso criterio para el diagnóstico (1, 2). Estos criterios permitieron la recopilación de casos clínicamente homogéneos que fueron esenciales para los estudios genético moleculares. El aislamiento del gen (FRDA) de la Ataxia de Friedreich, en 1996 (4), fue un éxito aplicado al estudio de las enfermedades neurodegenerativas hereditarias. Gracias a este descubrimiento se hicieron posibles la comprobación genética, el genotipo, las correlaciones del fenotipo, la patofisiología y los posibles acercamientos al tratamiento de la enfermedad.

El gen de la Ataxia de Friedreich, (FRDA) según la nomenclatura de la Organización del Genoma Humano, se localiza en el brazo largo de cromosoma 9 (5, 6). Su transcripción (ARNm) funcionalmente pertinente, tiene un tamaño de 1,3 Kb. y contiene cinco exons, 1 a 5a. La proteína que codifica el gen está formada por 210 aminoácidos y se llama frataxina (4).

El gen se expresa en todas las células, pero en proporciones distintas en tejidos diferentes y durante el desarrollo (4, 7, 8). En las personas adultas, el ARN mensajero, a partir del cual se traduce la frataxina, es muy abundante en el corazón y en el cordón espinal, seguidos por el hígado, el músculo esquelético, y el páncreas. En los embriones de ratón, la expresión empieza en el neuroepitelio al día 10,5 en el tejido embrionario (E10,5), alcanzando su nivel más alto a E14,5 en el periodo postnatal (7, 8). En los ratones en vías de desarrollo se encuentra niveles altos del ARNm a partir del cuál se elabora la frataxina en el cordón espinal, particularmente en el toraxlumbar, en los ganglios de la raíz dorsal, en las células nerviosas, proliferando en las periventriculares divididas en zonas, en las placas corticales, eminentemente en los ganglios, en el corazón, en el esqueleto axial, y en algún epitelio y tejidos del mesenquima. En el cerebro del ratón adulto el nivel de ARNm de la frataxina está reducido y principalmente confinado al ependyma, pero hay restos en el cordón espinal y en la raíz de los ganglios dorsales (8). De manera interesante (estimado por un borrador de análisis), los niveles de la proteína permanecen altos en el humano adulto, en el cerebro del ratón y el cerebelo (9) (nuestra la observación inédita).

La mutación más corriente que causa la ataxia de Friedreich (98 %) es una hiperexpansión de triplete de GAA repetido en el primer intron del gen de la frataxina (4). La enfermedad se manifiesta cuando aparecen entre 70 a más de 1.000 tripletes. Normalmente se encuentran de 600 a 900 repeticiones. Debido a la naturaleza recesiva de la enfermedad, los individuos afectados tienen las expansiones en ambos alelos homólogos del cromosoma 9, mientras los portadores, heterozigotos, sólo presentan expansión en uno de los alelos, siendo clínicamente normales. Estas expansiones del triplete, causantes de la enfermedad, son inestables en la transmisión de padres a hijos (10 - 13). La transmisión paternal se acompaña a menudo por una reducción de las repeticiones. De acuerdo con esto, en los portadores masculinos la repetición más pequeña se encuentra en el esperma y en los leucocitos (10). La transmisión maternal puede producir con igual probabilidad o una mayor expansión o bien una reducción (10, 14). La inestabilidad también tiene lugar durante las divisiones de las células somáticas: llevando a un grado de mosaicismo somático para la expansión y clasificándolo según el tamaño que se ha observado en los leucocitos, fibroblastos, y cerebro de pacientes de ataxia de Friedreich (11, 12).

La ataxia de Friedreich es la más corriente de las enfermedades originadas por repeticiones de expansión GAA que ha sido identificada hasta ahora. La repetición de tripletes aparece con una frecuencia de en 1 por cada 90 europeos: los cuales son portadores de la expansión y, por lo tanto, pueden transmitir la enfermedad a sus descendientes (13). En los cromosomas normales puede distinguirse dos clases de alelos con la expansión GAA. En el normal corto (SN) los alelos contienen de 6 a 10 tripletes GAA, y se considera tal cantidad para el 83 % de cromosomas en personas caucásicas. En normal largo (LN) los alelos contienen más de 12 tripletes, y se considera tal cantidad para el 17 % de cromosomas en caucásicos (13, 15). Los alelos LN constituyen un factor de riesgo, pues son alelos que pueden expandirse en el futuro hasta llegar a alcanzar las magnitudes que sí causan la enfermedad: indicado por el análisis de desequilibrios (13) y por la observación directa de expansiones catastróficas en alelos LN llevando a repeticiones patológicas conteniendo centenares de tripletes (13, 15). Algunos alelos LN son interrumpidos por una repetición del hexanucleótido (GAGGAA), que probablemente tiene un papel estabilizante (13, 15). La repetición de tripletes de GAA que produce la expansión, y como consecuencia causa la ataxia de Friedreich, sólo se encuentra en individuos de origen Europeo, Norteafricano, de Oriente Medio e Hindú. El análisis de marcadores estrechamente unidos sugiere que esas expansiones surgieron a través de dos únicos procesos: Primero, aparición de alelos LN en África, y segundo, aparición de alelos LN mayores y llevando a expansiones patológicas en los antepasados de los Indoeuropeos y Norteafricanos. Una mejor explicación de estos resultados es que la ataxia de Friedreich no puede existir entre los africanos subsaharianos, amerindios, y personas originarias de China, Japón, y del sureste de Asia (16).

Las expansiones de tripletes GAA repetidos inhibe la expresión del gen de la frataxina. Se han encontrado niveles muy reducidos de ARNm de la proteína frataxina en muestras de tejidos y de células en pacientes de ataxia Friedreich. La reducción es proporcional al tamaño de la expansión de la repetición del triplete GAA, particularmente al del más pequeño de los dos alelos (9). Las magnitudes de la expansión de tripletes GAA asociados con la ataxia de Friedreich puede formar estructuras helicoidales en condiciones fisiológicas que pueden producir enredos en la molécula de ADN (17). Los tripletes son conocidos por poder bloquear la transcripción (18) proporcionando un mecanismo para la expresión inhibida del gen en la ataxia de Friedreich (19).

Hallazgos experimentales indican que las expansiones más pequeñas permiten una mayor expresión del gen (9, 19, 20). El tamaño de la expansión tiene influencia en la severidad del fenotipo. Se ha establecido firmemente, una correlación directa entre el tamaño de las repeticiones GAA y un inicio más temprano de la enfermedad, una necesidad precoz del uso de silla de ruedas, progresión más rápida del proceso degenerativo y presencia de otras manifestaciones típicas de la enfermedad pero que no siempre afectan a todos los pacientes de Ataxia de Friedreich: siendo un indicativo de una degeneración más acusada (11, 14, 21 a 24). No obstante, las expansiones de tripletes GAA sólo suponen aproximadamente un 50 % de la variabilidad en la edad de inicio, indicando que hay otros factores que influyen en el fenotipo. Éstos pueden incluir el mosaicismo somático para la expansión, según tamaño, las variaciones en el gen de la frataxina, genes modificadores y factores medioambientales.

Aproximadamente el 2 % de los cromosomas en la ataxia Friedreich tienen repeticiones GAA normales, pero aparecen cosas sin sentido, o mutaciones de sitio de empalme afectando finalmente a la frataxina codificada en la secuencia (4, 25, 26). A todos los individuos afectados con una mutación puntual (hasta ahora identificada en individuos heterocigotos), les aparece una expansión de tripletes GAA en el otro cromosoma 9 homólogo. Es posible simplemente que no se haya encontrado todavía homocigotos para las mutaciones puntuales, o bien porque las mutaciones puntuales son raras, pero lo más probable es que ser homocigoto para las mutaciones puntuales en el gen de la frataxina sería un fenotipo letal: como ha sido sugerido por la reciente observación técnica en el intento de crear ratones modelo "knock out" totalmente carentes de frataxina: Estos mutantes mueren durante el desarrollo embrionario (27). (P. Ioannou, comunicación personal).

Algunas mutaciones sinsentido están asociadas con un fenotipos atípico, más apacible y con una progresión lenta, sugiriendo en la conformación de las proteínas deformadas mantienen alguna función residual. Los pacientes que llevan la mutación G130V presentan un inicio temprano, pero la progresión es lenta, no aparece disartria, la ataxia de los miembros es apacible, y hay retención de los reflejos (25, 26). Unos fenotipos similares tienen lugar en individuos con las mutaciones D122Y25 y R165P28. Por razones desconocidas, la atrofia óptica es más frecuente en pacientes con mutaciones puntuales (50 % de los casos) (25).

La frataxina no se parece ninguna proteína de función conocida. Está muy conservada durante la evolución (4), con homólogos en mamíferos, invertebrados, levadura, y plantas. La proteína se localiza en la matriz mitocondrial (9, 29, 30). Pueden romperse los genes fácilmente (mediante la técnica del "knock out") en la levadura, proporcionando una herramienta poderosa para estudiar su función. Esto se ha hecho el gen (YFH1) homólogo de la frataxina en la levadura. La mayoría del efecto del "knock out" en el gen YFH1 en la levadura, es hacer que pierda la habilidad de llevar a cabo la fosforilación oxidativa, formando colonias pequeñas con defectos o pérdida del ADN mitocondrial que no puede crecer en el substrato fermentable (29, 31). El hierro aumenta en la mitocondria a expensas del hierro del citosol (10). La pérdida de la competencia respiratoria requiere la presencia de hierro en el medio cultivado. La concentración férrica en el medio aumenta, sugiriendo que el daño mitocondrial permanente, es consecuencia de la toxicidad férrica. En las mitocondrias el hierro puede reaccionar con especies de oxígeno reactivo (ROS) que se forma en estos orgánulos. Incluso en las mitocondrias normales, algunos electrones escapan prematuramente de la cadena respiratoria, principalmente reduciendo la ubiquinona (o probablemente sus formas semiquinonas), reduciendo directamente el oxígeno molecular a radical superoxido O2- .

En la Mitocondria el Mn-dependiente de la dismutasa del superoxido (SOD2) genera el peróxido de hidrógeno (H2O2) a partir del radical superóxido O2- . Entonces la peroxidasa del glutation oxida el glutation y transforma el agua oxigenada (H2O2) en agua (H2O). El hierro (Fe) puede intervenir en este proceso formando un ciclo con el O2- y el H2O2, como sigue:

(Reacción de Fenton).
Fe(III)3+ + O2- + 2H+ -------------> Fe(II)2+ + H2O2
Fe(II)2+ + H2O2 ----------------> Fe(III)3+ + OH0 + OH-
.

El radical hydroxilo (OH*) producido por la reacción de Fenton es muy tóxico y causa peroxidación de lípidos y daños en las proteínas y el ácido nucleico. El hecho de que ocurra la reacción de Fenton en &#144: células de la levadura YFH1, sugiere que su sensibilidad está aumentada frente al H2O2 (29).

En &#144: células YFH1 de la levadura, resultan dañadas varias enzimas, incluyendo los complejos de la cadena respiratoria I, II y III y la aconitasa (32). Estas enzimas tienen en común que contienen clusters hierro-azufre (Fe-S) en sus sitios activos. Las proteínas Fe-S son especialmente sensibles a los radicales libres (33). Aún no se sabe a ciencia cierta si las proteínas Fe-S resultan dañadas por los radicales libres o su síntesis es directamente afectada por la relativa falta del homólogo de la frataxina. La alteración de la frataxina causa anomalías en el metabolismo férrico de las células de levadura. La razón para la acumulación férrica mitocondrial en las &#144: células YFH1, puede, en principio, ser debida a un incremento de captación férrica, o a un uso inadecuado, o una exportación disminuida del hierro en éstos orgánulos. Los experimentos de inducción involucrando la expresión de la frataxina en un plásmido transformado en &#144: las células YFH1 de levadura, indican que la proteína estimula un flujo de hierro fuera de la mitocondria (34), pero esto puede ser otra vez compatible con las diferentes funciones de la frataxina.

Cuando el hierro es atrapado en un fragmento de la mitocondria, el hierro citosólico decrece, produciendo una marcada inducción en la alta afinidad del sistema de transporte férrico de la membrana celular, normalmente esto no ocurre en las células de levadura que están "repletas" de hierro (29). Como consecuencia, el hierro cruza la membrana plasmática en grandes cantidades y por ello se acumula en la mitocondria, metiendo así a la célula en un circulo vicioso.

Es interesante comprobar que la síntesis del grupo hemo es normal en &#144: células YFH1 de la levadura, lo que nos hace pensar que la función de los quelantes de hierro y del transporte del hemo fuera de la mitocondria no se ven afectados por la deficiencia de frataxina.

El homologo de frataxina en la levadura yfh1p (proteína producto del gen YFH1), podría ser una proteína captadora de hierro (35 ) Los monomeros de yfh1p no son capaces de captar el hierro, pero experimentos con filtración de gel y análisis por ultracentrifugación han sugerido que se puede formar un complejo yfh1p-hierro de peso molecular alto cuando el hierro se agrega a la proteína a una proporción molar 40:1. Hay un pequeño porcentaje de compuestos intermedios que contienen 2, 3 o más moléculas de complejos yfh1p-hierro formados por una proporción baja hierro-proteína. El alto peso molecular del complejo se calcula que es debido a que éste contiene aproximadamente 60 moléculas de frataxina y 4.000 átomos de hierro.

Los análisis de fracciones por el método de filtración de gel de extractos de levadura sugieren que el alto peso molecular de los complejos que contienen yfh1p pueden existir en estado vivo. Según estos datos, los yfh1p podrían proteger al hierro en la mitocondria de los contactos con radicales libres. Subsecuentemente, el hierro en estos complejos parece ser fácilmente accesible por los quelantes, probablemente biodisponibles, los yfh1p podrían ser una especie de acompañantes del hierro mitocondrial y, por su ausencia, resultan dañados varios procesos de biosíntesis y de transporte acumulándose el hierro en una forma tóxica y redox-activa.

La estructura de la frataxina es objeto de un análisis intensivo. Los datos preliminares indican que la frataxina madura es una proteína globular conteniendo una hélice N-terminal, una región de lámina ß en el centro, y otra hélice C-terminal. Los aminoácidos hidrófobos están encerrados dentro de ésta estructura, con algunos residuos cargados en la superficie. En poco tiempo tendremos una correlación entre los datos estructurales y los resultados bioquímicos.

La frataxina humana normal es capaz de complementar el defecto en &#144: células YFH1, mientras que la frataxina humana que lleva una mutación de punto encontrada en pacientes con ataxia de Friedreich es incapaz de hacerlo (31) sugiriendo claramente que la función de yfh1p está conservada en la frataxina humana. Varias observaciones refuerzan la hipótesis de que en la ataxia de Friedreich tienen lugar una alteración en el metabolismo férrico, daños por radicales libres y trastornos mitocondriales.

La implicación del hierro fue sugerida hace veinte años debido al hallazgo de los depósitos de este metal en células del miocardio de pacientes con ataxia de Friedreich (36 ). La acumulación férrica ha sido demostrada por imágenes de resonancia magnética (MRI) en el núcleo dentado: una estructura muy afectada en el sistema nervioso central (37). Hemos confirmado un incremento de hierro en el núcleo dentado por análisis de espectroscopia de absorción atómica en muestras patológicas de tres pacientes de ataxia de Friedreich (datos inéditos nuestros). La observación de un moderado, pero significativo aumento de la concentración férrica en la fracción mitocondrial de los fibroblastos de los pacientes de ataxia de Friedreich nos confirma la hipótesis (38 ).

La tensión oxidativa es sugerida por la observación de que los fibroblastos de pacientes con ataxia de Friedreich son sensibles a bajas dosis de H2O2, lo cual induce a una contracción celular, condensación nuclear, y muerte celular por apoptosis a bajas dosis en los fibroblastos de control (39 ) (observaciones inéditas nuestras). Este hallazgo sugiere que también las células no afectadas presentan "un riesgo" al estado oxidativo como consecuencia de un defecto genético primario. El indicio del posible papel de los radicales libres proviene de la observación de que la deficiencia en vitamina E produce un fenotipo similar al de la ataxia de Friedreich (40). La vitamina E se localiza en la membrana de la mitocondria, dónde actúa como un basurero para los radicales libres (41). Se ha demostrado que el trastorno mitocondrial se produce, en vivo, en los pacientes con ataxia de Friedreich. El análisis por espectroscopia de resonancia magnética del músculo esquelético muestra que hay una proporción reducida de síntesis de ATP después del ejercicio en correlación inversa con el tamaño de expansión GAA (42). Además Rötig y colaboradores (32) han encontrado los mismos trastornos multienzimáticos presentes en &#144: YFH1 de la levadura, (déficit en los complejos respiratorios I, II y III, y de aconitasa) en las biopsias del endomiocardio de dos pacientes de ataxia de Friedreich (32). También pudiera tener lugar una anomalía general del metabolismo férrico en pacientes de ataxia de Friedreich, como sugiere el alto nivel encontrado del receptor transferrina circulante, principal portador de hierro en las células humanas (43). Como &#144: YFH1 de la levadura, aumentan la captación férrica celular debido al bajo nivel de hierro citosólico, se cree que pudiera ocurrir en los pacientes humanos un proceso similar.

En las eucariotas superiores, el hierro del citosol es captado por dos proteínas (IRP-1 e IRP-2), que regulan la expresión de varios genes a nivel post-transcripcional. Cuando son activados por un bajo nivel de hierro, captan una secuencia de elementos específicos (elementos sensibles al hierro IREs) presentes en algunos mRNAs. El IRP estabiliza al mRNAs que codifica las proteínas que refuerzan la captación férrica, como el receptor transferrina (TfR), y bloquea la traducción del mRNAs que codifica proteínas que utilizan o guardan el hierro, como la ferritina (44). El IRP-1 es una aconitasa del citosol que contiene un cluster hierro-azufre. Se activa no sólo como respuesta a un bajo nivel de hierro citosólico, sino también por la presencia de radicales oxidantes, como oxido nítrico (NO) y monóxido de carbono (CO) (44).

Si la pérdida de la actividad de la aconitasa observada por Rötig y colaboradores (32) involucrase a las enzimas del citosol, podría producir cambios en la abundancia de las proteínas reguladoras IRP-1 (32), incluyendo el incremento observado en el receptor transferrina.

Debemos remarcar que la expresión de la frataxina no parece estar regulada por la cantidad de hierro presente (nuestras observaciones así parecen indicarlo) y su mRNA no contiene ningún IRE.

Eliminar el exceso de hierro mitocondrial y/o tratamientos antioxidantes son las vías que se intentarán en un principio. Sin embargo, quitar el exceso de hierro mitocondrial es problemático con las sustancias actualmente disponibles. La desferioxamina (DFO) es eficaz para la quelación férrica en el fluido extracelular y en el citosol, pero no directamente en la mitocondria. Además, la toxicidad de DFO puede ser mayor cuando no hay excesiva carga férrica global. Por ello, la terapia de quelación nos plantea varios interrogantes: probablemente será probada en ensayos piloto que involucren a un número pequeño de pacientes estrechamente supervisados. La eliminación férrica por "phlebotomy" (flebotomía ?), aunque menos arriesgado, presenta las mismas incertidumbres en cuanto a su posible eficacia.

Hay muchos antioxidantes potencialmente utilizables: éstos incluyen una larga lista de moléculas con mecanismos específicos de acción y propiedades farmacocinéticas. Para tener potencial y ser eficaz en la Ataxia de Friedreich, un antioxidante debe proteger contra el daño causado por los radicales libres involucrados en esta enfermedad, en particular OH *, debe actuar en la mitocondria, y debe de ser capaz de cruzar la barrera cerebro-sangre. En este momento, los derivados de CoQ, como su análogo de cadena corta Idebenona, parecen ser las moléculas interesantes y son objeto de ensayos piloto (45 ).

Sin embargo, se necesitan nuevos conocimientos sobre la función de la frataxina y su patogénesis para progresar hacia un tratamiento eficaz de la enfermedad. A largo plazo, la sustitución del gen, el reemplazo de la proteína, o la reactivación de la expresión de la frataxina endógena pueden ser vías para lograr la curación.

Reconocimientos:

El trabajo de laboratorio del autor estuvo subvencionado por el Medical Research Council, de Canadá, y el National Institute of Neurological Diseases and Stroke (NINDS) y la Muscular Dystrophy Association (MDA), estos dos últimos de EE.UU.

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