55- UN MODELO DE SISTEMA PARA ESTUDIAR LA INESTABILIDAD DE LA EXPANSIÓN DE REPETICIÓN DE TRIPLETE GAA EN LA ATAXIA DE FRIEDREICH. Por el Dr. SANJAY I. BIDICHANDANI (Profesor adjunto, Bioquímica & Biología Molecular, y Pediatría / Centro Universitario de Ciencias de la Salud de Oklahoma). Copiado del boletín de la National Ataxia Foundation, otoño 2000. Traducción de Flor Santillán.
Esto es una actualización de la investigación llevada a cabo por la National Ataxia Foundation durante1999.
Introducción: La ataxia de Friedreich, la ataxia hereditaria más corriente, está causada por una deficiencia de frataxina. La frataxina es esencial para el mantenimiento de niveles apropiados de hierro en la mitocondria, la planta energética de la célula. En 1996, un estudio mostró que esta deficiencia de frataxina era causada por una expansión de repetición de triplete GAA (de 100 a 1700 tripletes) en ambas copias del gen que codifica la frataxina (Ref. 1). La personas inafectadas también tienen secuencias de triplete GAA en sus genes de la frataxina, pero generalmente son muy cortas (menos de 40 tripletes). La secuencia expandida de repetición de triplete GAA mayor de 100 tripletes tiene como resultado una obstrucción del gen de la frataxina (Ref. 2) y la consecuente deficiencia de esta proteína. Varios parámetros de la función del gen y la severidad de la enfermedad han mostrado una correlación con la magnitud de la repetición: las mayores repeticiones están asociadas con un incremento de deficiencia en frataxina (y su función) y la severidad clínica. Conocer los factores que determinan la magnitud de la expansión de GAA, posiblemente distinta en tejidos diferentes, es claramente importante para entender la patogénesis de la enfermedad y, quizás, en el futuro pudiera aportar pistas en las estrategias para dar marcha atrás a este proceso patológico.
Casi el 1 por ciento de la población en general porta una gran expansión de repetición de triplete GAA en una de las copias de su gen de la frataxina (con una notable excepción de la población Japonesa), lo cual hace que esta mutación en el gen humano sea bastante corriente. Estas personas, denominadas "portadoras", tienen aproximadamente un nivel medio de frataxina que está dentro de la normalidad y es compatible con estar libre de la enfermedad.
Aún necesitan ser contestadas muchas preguntas. ¿Qué es lo que hace al triplete de repetición GAA, por otra parte normal, expanderse hasta alcanzar una magnitud que sí produce la enfermedad? ¿Qué es lo que hace que una repetición con aproximadamente 40 tripletes (premutación) se expanda hasta contener más de diez veces su magnitud original (mutación) en una sola transmisión generacional? ¿Por qué sucede tan frecuentemente como se espera de los estudios de población? ¿Por qué los pacientes tienen variantes en la repetición y, por consiguiente, una gama amplia de severidad clínica? ¿Por qué los diferentes tejidos de un mismo paciente tienen distintas repeticiones? ¿Podría ser controlado el proceso de expansión o reducción de la magnitud de la repetición de triplete GAA?.
Se ha diseñado un modelo simple de sistema para imitar en el laboratorio la inestabilidad de la repetición GAA que posiblemente pudiera ayudar a dar respuesta a algunas de las preguntas anteriores.
Desarrollo de un modelo de sistema para estudiar la conducta de la espansión de repetición de triplete GAA: Los linfocitos, células circulantes en la sangre, pueden ser "transformados" en células inmortales linfoblastos en laboratorio utilizando el virus Epstein Barr. Estas células son útiles para analizar ADN, ARN, proteínas, y ciertos procesos psicopatológicos en pacientes con enfermedades genéticas, y puesto que también son inmortales aseguran un suministro permanente de material celular. Aunque estas células no puedan ser ideales para el estudio de algunos genes, ofrecen un punto de vista para la conducta "dinámica" de mutaciones como las expansiones de repetición de triplete en el contexto de un ambiente celular humano. Además, su naturaleza inmortal nos permite rastrear los cambios de cómo estas células se dividen en un periodo prolongado de tiempo.
Nuestro modelo experimental de sistema es como sigue (Ref. 3):
1- Se determina el tamaño de expansión GAA usando ADN aislado de muestras de sangre de pacientes y de portadores.
2- Se transforma los linfocitos de estos individuos en células linfoblastos y se determina el tamaño de las expansión GAA usando ADN de estas células transformadas
3- Se cultiva estas células en una incubadora bajo condiciones especificadas y se analiza la conducta de la repetición GAA extraída del ADN de varias generaciones (pasajes) de estas células cultivadas.
Fueron seleccionados 7 pacientes y 9 portadores para estudiar una amplia gama de tamaños de expansión: los cromosomas analizados contenían entre 97 y 1250 (promedio = 744) tripletes de repetición GAA. Los tamaños de la repetición fueron calculados mediante análisis de ADN utilizando el método "Southern blot". Estas líneas celulares fueron pasadas por más de 20 a 39 generaciones (un solo pasaje involucraba una semana de cultivo).
La expansión de repetición de tripletes GAA se acorta cuando los linfocitos son transformados en células linfoblastos: Previamente a la transformación, fueron analizados 20 cromosomas en 6 pacientes (6 x 2) y 8 portadores. Las expansiones fueron en tamaño de 111 a 1105 tripletes (promedio = 750). En la siguiente transformación, 12 de estos 20 cromosomas (es decir el 60 %) mostró reducciones que iban a 67 de 236 tripletes (el tamaño medio de reducción = 134). Los restantes 8 cromosomas no mostraron ningún cambio en el tamaño. Significativamente, ninguno de los 20 cromosomas así estudiados mostró una expansión. Puesto que sólo una proporción pequeña de linfocitos es seleccionada durante el proceso de transformación, esto puede significar o que las células con repeticiones cortas tienen ventaja selectiva, o que durante la transformación las repeticiones tienden a la baja, quizás debido a los cambios específicos en la fisiología celular.
La expansión de repetición de triplete GAA es muy inestable en los pasajes células linfoblastos: Quizás el hallazgo más significativo de este proyecto haya sido el descubrimiento de que la expansión de repetición de triplete GAA se altera significativamente en el tamaño cuando las células imitan en laboratorio el paso generacional (Ref. 3). Básicamente, cuando las células se multiplican en los tubos de ensayo, el tamaño de repetición GAA no permanece estático. Potencialmente, éste es un hallazgo importante, puesto que este sistema puede usarse como modelo en la investigación de la "inestabilidad" de repetición de tripletes GAA dentro del contexto de las células humanas.
La magnitud de cambios observada en las varias expansiones GAA se detalla gráficamente en la figura 1A (células de pacientes) y 1B (células de portadores). Nótese que se pintan sólo los cromosomas que mostraron cambios de magnitud en las dos figuras. Mostraron estos cambios 4 de 7 en células de pacientes y 5 de 9 en portadores. Como puede observarse en ambos gráficos, se ven cambios significativos en las expansiones GAA de todos los tamaños y en todas las fases del experimento. No se aprecia diferencia significantiva en la conducta de las expansiones entre células de pacientes y de portadores. Mientras la reducción fue muy corriente durante la transformación de linfocitos, las expansiones y reducciones fueron igualmente frecuentes durante el pasaje de células linfoblastos. Algunas expansiones GAA parecen ser más inestables que otras: seis de ellas cambiaron más de una vez de tamaño durante el experimento.
Dado que la expansión de repetición de triplete GAA es capaz de variar significativamente durante la división de células somáticas, es concebible que pueda surgir una variación de magnitud similar durante el desarrollo fetal en órganos diferentes. Es probable que ésta sea la base subyacente para la diferencia observada entre la magnitud de repetición en ADN de la sangre (lo usado en la mayoría de los pacientes) y la severidad clínica global de algunos pacientes, lo último obviamente está altamente controlado por la magnitud de la repetición en tejidos afectados patológicamente. Recientemente, hemos informado de un paciente en el cual la magnitud de repeticiones en el ADN de la sangre (y en otros varios tejidos) curiosamente no estaba asociada con un inicio tardío, sin embargo los síntomas empezaron después de los 40 y la ataxia de Friedreich era excepcionalmente apacible (Ref. 4).
Aunque éste es un hallazgo interesante y representa un modelo de sistema potencialmente útil, es necesario tener en cuenta ciertas advertencias. Aunque estas células derivan de pacientes y de portadores, las células linfoblastos no derivan, per se, de células/tejidos relacionados con la enfermedad. Además, el proceso de "immortalization" de linfocitos podría haber introducido ciertos cambios genéticos adicionales que pudieran ser responsables de la conducta observada en la repetición GAA. No obstante, de momento, éste es el único ensayo disponible para estudiar las alteraciones de expansiones GAA en el contexto de las células humanas.
La repetición normal de tripete GAA es estable en el pasaje a células linfoblastos: Mientras los cromosomas expandidos frecuentemente mostraron cambios en la magnitud, ninguno de los nueve cromosomas normales estudiados en el mismo experimento (cromosomas normales en nueve portadores) mostró ninguna evidencia de inestabilidad. Sin embargo, todos los cromosomas normales en nuestro estudio contenían menos de nueve tripletes GAA, por lo que no puede extraerse ninguna conclusión con respecto a cromosomas largo-normales.
La expansión de repetición de triplete GAA es capaz de contraerse significativamente para contener una magnitud normal de repetición: Nuestro estudio sobre la inestabilidad de la repetición de triplete GAA también ha revelado un ejemplo dramático de inestabilidad del ADN. En una paciente femenina que había heredado las expansiones de ambos padres, pudimos demostrar en la muestra de una sangre la presencia de una pequeña proporción de ADN conteniendo una repetición normal (Ref. 3). Para asegurarnos de la no contaminación de la muestra o un posible fallo en el experimento, pedimos otra muestra de la paciente. La presencia de esa repetición normal se vio de nuevo. Se llevó a cabo un análisis más preciso de la secuencia de esta repetición normal, y encontramos que "la repetición normal", realmente contenida en el ADN, era de varias magnitudes, todas ellas dentro de una gama normal, yendo de 9 a 29 tripletes. Creemos que esto es indicativo de una reducción dramática que involucra a las células sanguíneas periféricas o a sus precursores. Otro grupo ha informado una reducción similar vista exclusivamente en el ADN del esperma en un paciente con ambos cromosomas expandidos en la muestra de su sangre. Estos resultados plantean una cuestión misteriosa: Si puede tener lugar una reducción completa aunque sea en casos raros y sólo involucrando una proporción de células, ¿las expansiones GAA podrían ser obligas a reducirse con un beneficio clínico significativo para el paciente?.
Conclusión: Ha sido desarrollado un oportuno modelo de sistema que permitirá un extenso estudio de la inestabilidad de las expansiones de repetición de triplete GAA.
Referencias:
1) Campuzano V., Montermini L., Moltò M.D. y compañeros. La ataxia de Friedreich: enfermedad autosómica recesiva causada por una intrónica expansión de repetición de triplete GAA. Science 271:1423-1427 (1996).
2) Bidichandani S.I., Ashizawa T., Patel P.I. La expansión de la repetición de triplete GAA de la ataxia de Friedreich interfiere con la transcripción y puede asociarse con una rara estructura de ADN. Am. J. Hum. Genet. 62:111-121 (1998).
3) Bidichandani S.I., Purandare S.M., Taylor E.E. y compañeros. La variación de la secuencia somática en la ataxia de Friedreich incluye reducción completa de la expansión de la repetición de trinucleótido GAA, variación de magnitud significativa en el pasaje a linfoblastos, y refuerza la mutagénesis flanqueando la secuencia. Hum. Mol. Genet. 8:2425-2436 (1999).
4) Bidichandani S.I., Garcia C., Patel P.I., Dimachkie M. Inicio muy tardío en la ataxia de Friedreich a pesar de grandes expansiones de repetición. Arch. Neurol. 57:246-251 (2000).
Reconocimientos: Agradecemos a pacientes y a sus familias por haber participado en este estudio. Gracias por la ayuda al Dr. Tetsuo Ashizawa, al Dr. Yadollah Harati, y al Dr. Hazem Machkhas. También agradecemos al Dr. Ashizawa sus muchas sugerencias útiles a lo largo del proyecto. Gracias a Ellen E. Taylor y Glenice Gumin por su excelente ayuda técnica. Esta investigación fue financiada por la National Ataxia Fundation y por las concesiones de la Americam Heart Association y por Friedreich's Ataxia Research Alliance (FARA).