Recuperación funcional en un modelo de ratón de Ataxia de Friedreich por transferencia del gen Frataxin con un vector HSV-1 Amplicon

Para caracterizar la expresión del transgén a nivel bioquímico hemos infectado las neuronas corticales primarias del ratón con empaquetado de los vectores pHLC y pHF del HSV-1 amplicon (figura 2a y b). Usando tubulin y actin como controles para la cantidad de cargamento (figura 2a, segundo y tercer paneles), análisis wester blot de extractos de cultivos de células neuronales de ratones loxP[frda] infectados con el aumento de cantidades del vector pHLC han revelado incremento en las cantidades de β-galactosidasa y expresión de recombinasa CRE (figura 2a, primero y cuarto paneles). Las cantidades que disminuyen correlacionadas de frataxina en los mismos extractos (Figura 2a, panel inferior) indican que la recombinasa expresada CRE era claramente funcional y capaz de inactivar el gene frda en las neuronas infectadas suprimiendo el exon 4 floxed (véase la referencia 18, y figura 2c). Confirmamos después nuestra capacidad de aumentar la expresión de la frataxina usando el vector pHF (figura 2b). Al usar los cebadores detectamos la expresión del mensajero ARN de la frataxina humana en las neuronas infectadas con el vector pHF, pero no en los controles no infectados (Figura 2b, cuadro de arriba) o en las neuronas infectadas con pHSVlac (datos no mostrados). La infección del vector de cultivos neuronales no afectó a la expresión de la frataxina endógena del ratón (Figura 2b, segundo cuadro) con respecto al control del ARN mensajero fosfato glyceraldehido deshidrogenasa (Figura 2b, tercer cuadro). Usando tubulin como control para la cantidad a cargar (Figura 2b, cuarto cuadro), el análisis western blot de extractos de neuronas pHF-infectadas mostró que la cantidad total de frataxina fue incrementada en comparación con los extractos de control (Figura 2b, tablero del fondo).

Figura 2: Análisis bioquímico de las ateraciones en frda y en frataxina provocaas por los vectores pHLC y pHF. (a) El análisis Western blot de neuronas corticales primarias de los ratones loxP[frda] infectaron con volúmenes crecientes (0–50 µl) de pHLC. Los extractos celulares fueon hechos 6 días después de la infección y los Western blot sondeados con anticuerpos anti ß-galactosidasa (ß-chica), ß-tubulin (tubulin), actin, recombinasa CRE (CRE), y frataxina (1,250 anticuerpos policlonales).

Mediante la eliminación frda CRE en el tronco cerebral de los ratones loxP[frda] se povoca el déficit de coordinación motora. En los pacientes de FA, además del cordón espinal, los cambios degenerativos son notados en el tronco cerebral y en el cerebelo. Intentando desarrollar un modelo animal con alta sensibilidad a efectos terapéuticos, razonamos que la modulación de un pequeño grupo de neuronas importantes por la administración focal de vectores virales en el cerebro, podría ser suficiente para provocar un fenotipo atáxico. A continuación hemos inyectado el vector pHLC en la médula de los ratones loxP[frda] y la función recombinasa CRE es confirmada, in vivo, por la cadena de reacción polimerasa (PCR) (Figura 2d) usando los cebadores específicos P3 y P5 para descubrir el alelo frda Δ anulado (Figura 2c): el producto específico PCR para el aleleo Δ podría descubrirse del ADN genómico del tronco cerebral del los ratones loxP[frda] inyectados con cualquier concentración baja (Figura 2d, divisiones 2 y 3) o alta (Figura 2d, división 4) del vector pHLC, pero no desde el ADN genómico de los inyectados con pHSVlac (Figura 2d, división 1). Puesto que el ADN genómico se preparó a partir de una muestra de tallo cerebral incluyendo el sitio de inyección, se podría esperar que la proporción de células pHLC-infectadas en la masa total disectada de tejido fuera bastante baja. De hecho, el producto específico PCR por el no anulado alelo L3 (Figura 2d, tablero de arriba) era claramente perceptible, y no mostró ningún cambio usando pHLC a dosis bajas (Figura 2d, divisones 2 y 3) o altas (Figura 2d, división 4), como la mayoría de las neuronas en la muestra disectada no fue infectada por el vector viral.

DISCUSIÓN:
En este estudio, nuestra meta principal era generar datos de prueba inicial para terapia del gen de la frataxina en el tratamiento de la neuropatologia Ataxia de Friedrich. Como modelos animales, hemos generado ratones knockout de frataxina localizada por objetivo la oliva inferior de ratones transgénicos loxP[frda] con vectores virales recombinasa CRE. La ventaja principal de nuestro modelo es que el cerebro del ratón adulto contiene sólo ~30,000 neuronas olivares (22, 23) y el análisis histológico de varios ratones mutantes atáxicos muestra déficit neuronal olivar entre 20 y 60 % (23-27). Así, nuestro modelo debe ser sensible a dosificación de vector relativamente baja, permitiendo al HSV-1 amplicon el uso de stocks no concentrados, a los cuales previmente hemos hallado la característica de exhibir toxicidad despreciable en este área (16). De hecho, nuestros resultados muestran que a estas concentraciones de vector, in vivo, pueden descubrirse cambios en la actuación motora antes que la expresión del transgén, la cual requiere un décuplo de concentraciones. Esto solamente era debido al límite de sensibilidad de detección, puesto que hemos sido capaces de detectar la actividad CRE recombinasa, in vivo, incluso a concentraciones bajas de vector. Aquí usamos la excisión del gen frda en las neuronas olivares para provocar un déficit en la actuación en el rotarod que fue estable por un periodo de 4 meses tras el experimento. También mostramos la recuperación del déficit en la coordinación motora por la restauración de la expresión de la frataxina usando un vector HSV-1 amplicon. Esta recuperación funcional era sorprendentemente completa, en vista del hecho de que la restauración de la frataxina sólo puede ocurrir en el subconjunto solapado de neuronas transducidas por ambas: primeras y segundas inyecciones. Son posibles varias explicaciones. Primero, el rescate del gen frda de un subconjunto de neuronas puede ayudar a la supervivencia de otros, estimulando la generación de factores tróficos y/o conexiones. Segundo, resultados similares fueron obtenidos por Fernández et al. (28), quién usó un modelo de rata atáxica en la cual provocaron la ablación de más del 80 % de la oliva inferior con 3-acetylpyridine. En este estudio, de tratamiento insulina factor de crecimiento 1, se produjo la supervivencia de sólo 27 % de las neuronas olivares totales, pero, notablemente, fue observada una total recuperación funcional. Estos autores no sólo atribuyen la recuperación funcional al incremento de supervivencia neuronal, sino también al inducido crecimiento axonal. Tercero, cuando la recuperación de coordinación motora alcanza cierto umbral, otros mecanismos compensatorios de aprendizaje y/o función motora puede ser suficientes para lograr un nivel normal de actuación en las tareas dadas como la prueba del rotarod.

El nivel de proteína frataxina expresado por nuestro vector pHF era similar a los niveles endógenos observados en las neuronas tipo natural (comparar las divisiones izquierda y derecha en cuadro del fondo de Figura 1d), indicando que habíamos obtenido fisológicamente niveles relevantes de expresión del transgén. Esto puede ser particularmente importante, por la sobrexpresión del alto nivel de frataxina por el lentiviral o bien se hubiera informado previamente de vectores virales adenoasociados como tóxicos en fibroblastos de pacientes de FA (13). Hemos demostrado rescate del fenotipo de fibroblastos de FA recientemente con toxicidad despreciable usando vectore HSV-1 amplicon llevando el locus entero FRDA (29) el cual resulta en niveles fisiológicos de expresión. También se conoce que la expresión de frataxina es reducida al ~40 % en asimptomáticos portadores humanos de la patogénica mutación FRFA (30), indicando el nivel alto de expresión de frataxina no es requerido para la recuperación terapéutica. En este trabajo, a pesar del hecho de que la expresión de los promotores virales se ha observado disminuir significativamente en las neuronas in vivo, hemos usado amboscitomegalovirus y promotores HSV-1 IE4/5 paea conducir la expresión del transgén por varias razones: primero, necesitamos sólo expresión transitoria de recombinasa CRE (conducido por el promotor del citomegalovirus) para efectuar la excisión frda en las neuronas loxP[frda]; segundo, en contraste con otras areas del cerebro (31), hemos observado previamente que en la oliva inferior y el cerebelo, la expresión a partir del promotor IE4/5 es estable por más de 40 días (16); tercero, para este estudio de prueba de concepto, los vectores amplicon simples se usaron por la facilidad de construcción. Nuestros estudios continuados se enfocan en el uso de nuestros vectores HSV-1 amplicon llevando el locus genómico FRDA entero (29) como la presencia de secuencias nativas reguladoras, incluyendo el promotor, mejorador, y elementos del silenciador, probablemente producirá la expresión fisiológica y estable. Todas las estrategias terapéuticas apuntaron a aliviar el neurodegeneration en el FA y muchas otras condiciones neurológicas han fallado hasta ahora, enfatizando la necesidad de explorar otras opciones como la terapia génica. La entrega del transgén al sistema nervioso no es tarea fácil; la introducción de vectores en el torrente sanguíneo generalmente es ineficaz para llegar a las neuronas, y la mayoría de los métodos pasa por la inyección directa en el tejido nervioso, el cual, a su vez, predominantemente produce transducción en el área cercana al sitio de inyección. HSV-1 es una herramienta prometedora para la terapia génica del sistema nervioso (32) por varias razones: naturalmente, las neuronas son los objetivos para infección, y puede transportarse a lo largo del sistema nervioso para establecer la persistencia durante toda la vida; el virión tiene una capacidad de empaquetamiento sumamente grande; y el genoma permanece episomal en las células infectadas, evitando así un riesgo de mutagénesis insercional. Aquí hemos descrito la validacion funcional de los vectores virales HSV-1 para la entrega en el tronco cerebral mediante inyección estereotáxica para lograr la delección del gen focal y liberar a neuronas que afectan a la coordinación motora. Durante la preparación de este artículo, se ha informado de un nuevo modelo knock-out fe ratón trasgénico que mimetiza más estrechamente la enfermedad humana puesto que tienen transgenes FRDA que llevan la patológica repetición de expansiones GAA (33). Estos modelos animales facilitarán altamente nuestros prolongados estudios que apuntan a identificar los medios para lograr la penetración conveniente de nuestros vectores terapéuticos en los objetivos neuronales adecuados en la Ataxia de Friedreich.

Mantenimiento de los ratones. Los ratones han sido cuidados por personal especializado en el animalario del Centro de Biología Molecular, con acceso restringido. El protocolo experimental fue aceptado por el Cuidado Animal Institucional y el Comité de Uso, en el Centro de Biología Molecular, y siguió El Decreto europeo 86/609/CEE y su modificación postreior 2003/65/CE llevada a cabo por la ley española 1201/2005. Se realizaron todos los esfuerzos encaminados a minimizar el sufrimiento y el número de animales usados.

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