35- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA MUTACIÓN SCA10. Por el Dr. Tetsuo Ashizawa. Copiado del boletín (verano 2001) de la National Ataxia Foundation (NAF). Traducción de Gabriela Susana Dubedout.

El Doctor Ashizawa estudió en Tokio y Yokosuka (Japón) en la Universidad Kelo y en el Centro Médico Regional Naval de los Estados Unidos, en el Hospital General Allegheny de Pitsburg, y actualmente es Profesor de Neurología en el colegio de Medicina Baylor de Huston (Texas). Su más reciente proyecto de investigación fue la identificación de nuevas mutaciones en familias presentando fenotipos de ataxias espinocerebelares autosómicas dominantes y de Ataxia de Friedreich.

La mutación de SCA10 es una expansión gigante, no es una repetición de triplete, sino de cinco elementos. Todavía no sabemos cómo conduce la mutación a esta enfermedad peculiar, pero estamos trabajando en ello. La SCA10 posee un fenotipo muy característico (características observables) y la combinación de una ataxia relativamente pura con ataques. Más aún, algunos pacientes presentan un bajo coeficiente intelectual y algunos tienen polineuropatía sensorial mientras que otros tienen hiperreflexia (reacciones reflejas aumentadas). Algunas familias con expansiones muy amplias presentan insuficiencias hepáticas, anemia con bajo contenido de plaquetas y anomalías cardiacas. Aún desconocemos si estos síntomas extra, que no forman parte del sistema nervioso, son características regulares de la SCA10 cuando la expansión llega a ser gigante. Del 25 al 65 por ciento de los pacientes en la familia presentan combinación de ataxia con ataques. Una minoría de los pacientes posee síntomas adicionales. El comienzo de la enfermedad se produce entre los 10 y los 49 años y hay una variable, claramente llamativa, anticipación en cada familia.

El Dr. Pulst, de UCLA, y nuestro grupo registramos en el mapa del genoma, casi simultáneamente, el gen en el brazo largo del cromosoma 22. Al comparar ambas familias decidimos actuar rápidamente en colaboración y en la publicación de los trabajos. En dicha colaboración, descubrimos que se producía una recombinación. La recombinación consiste en una ruptura y una posterior reunión de las hebras del ADN para producir nuevas combinaciones de moléculas de ADN. Los marcadores que se encuentran muy cercanos al gen de la enfermedad se transmiten de generación en generación junto con el gen de la enfermedad. Si un gen y un marcador están separados por una distancia más larga, es más alta la probabilidad de que se produzca la recombinación. Observamos esas recombinaciones en ambas familias y decidimos que el gen debía encontrarse entre dos marcadores. En una convención, celebrada en México, tuve un encuentro con genetistas moleculares y con genetistas clínicos que tienen pacientes y familias que presentan ataxia y ataques. Son familias pequeñas que no podemos usar para un análisis conjunto, pero son valiosas ya que tanto la familia estudiada por el Dr. Pulst como la familia estudiada por nosotros y esas pequeñas familias provienen todas de México. Por lo tanto, asumí que las enfermedades de cada familia venían de una mutación común (efecto fundador). Chequeamos varios marcadores para ver si eran compartidos por todas las familias. De ser así, es probable que el gen esté en el área de dicho marcador.

Mientras tanto, ocurrió una cosa fantástica. El cromosoma 22, el cromosoma más pequeño (el más grande es el número 1) fue el primer cromosoma en ser secuenciado en forma completa por el proyecto del genoma humano. Sin embargo, había 11 pequeñas brechas. No obstante, sacamos ventaja de ello y encontramos el área del marcador común de esas familias con SCA10. Desafortunadamente, el final de esta región común presenta las 11 brechas que no pudieron ser secuenciadas, pero este espacio no es realmente muy grande, toda la región es de cerca de 500 kilobases, lo cual es bastante manejable.

En la anticipación, la edad de comienzo es cada vez más temprana en sucesivas generaciones y la enfermedad tiende a hacerse más severa. Las familias con SCA10 mostraron esta tendencia, y la anticipación es vista con mayor frecuencia en expansiones de triplete. Por lo tanto, buscamos las repeticiones de triplete en la región encontrada a partir de la información secuenciada en el proyecto genoma. Todas las repeticiones están interrumpidas, pero son repeticiones trinucleóticas. Chequeamos todas y cada una de ellas en los miembros afectados y no afectados de las familias y no pudimos encontrar anormalidades.

Abandonamos las repeticiones de triplete y empezamos a buscar otro tipo de repeticiones. Encontramos la repetición ATTCT en el intron 9 de un gen que es la región cromosómica común de las familias mencionadas. Ésta es una repetición polimórfica, lo que significa, en individuos normales, que varía la medida de la repetición. La mayoría de los pacientes tienen dos alelos, uno del padre y otro de la madre. Algunos tenían solamente un alelo (homocigotos). En ese caso, el padre y la madre tenían el mismo alelo. La variación de las repeticiones en los individuos normales que monitoreamos inicialmente fue de entre 10 y 22, y en el 82% estuvieron presentes dos alelos diferentes.

Hicimos el mismo análisis PCR para determinar la medida de la repetición ATTCT en los pacientes afectados y en sus familias. Algunos individuos no afectados, tienen dos alelos y otros tienen un alelo, pero los individuos muy afectados tenían solamente un alelo. Se debe recibir un alelo del padre y otro de la madre. Esto quiere decir que uno de los dos alelos no es ampliado por el PCR. El PCR es una técnica maravillosa, pero tiene sus limitaciones. Si la región a ampliar es bastante grande, no puede ser amplificada, tampoco si el área que el detonador del PCR une está borrada o sufre mutaciones. Ante la imposibilidad de distinguir dichas variantes decidimos emplear otra técnica de análisis denominada Southern Blot Analysis. Encontramos franjas anormales en pacientes afectados, pero no en individuos sanos. Calculamos la medida del ATTCT basada en la medida de la franja.

En la familia de nuestro estudio, todos y cada uno de los individuos afectados poseían franjas expandidas. Las franjas expandidas presentaban medidas diferentes, por lo tanto, la medida de la repetición era transmitida de forma inestable. En la transmisión materna, la medida no cambió casi nada. Extendimos el estudio y descubrimos que cuando el gen es transmitido por el padre, la medida de la expansión varía mucho, mientras que si proviene de la madre, casi no hay variaciones. También hallamos que la edad del comienzo y el número de repeticiones ATTCT tienen una correlación inversa. Esto significa que cuando el número de repeticiones sube, la edad de comienzo baja. Nos aseguramos de que esta expansión no fuera azarosa monitoreando un gran número de cromosomas normales. Monitoreamos 604 cromosomas: 250 caucásicos (origen Europeo),100 Japoneses, y 254 Mexicanos, y todos mostraron casi la misma distribución, variando entre 10 y 22 repeticiones con un pico de cerca de 13 y 14. La repetición se encuentra en el intron 9 dentro del gen denominado E46. Estudiamos si este gen es realmente el gen enfermo o no, pero la información es muy limitada y no pudimos confirmarlo.

De cualquier manera, cuando observamos el nivel de expresión de dicho gen, hallamos que el gen se encuentra altamente expresado en diferentes regiones del sistema nervioso central que incluyen el cerebro, el cerebelo y la espina dorsal. Fuera del tejido del sistema nervioso central, en el corazón, hígado, músculos y riñones también está altamente expresado. Éste es un gen expresado en el cerebro y un firme candidato de los mecanismos de la enfermedad. Al observar la región de la repetición ATTCT se ve otros genes, pero están a por lo menos 200 kilobases contracorriente o para abajo.

Algunos dicen que pudiera haber otro gen en el intron 9, pero hasta ahora no hemos podido detectar su presencia. Por el momento, creemos que este gen es el principal candidato. Buscamos la expresión del gen en pacientes, pero, hasta ahora, tenemos disponible solamente tejido sanguíneo y células, pero no tejido afectado.

En conclusión, la SCA10 tiene síntomas peculiares de una ataxia espinocerebelar relativamente pura combinados con ataques. Algunos pacientes tienen sólo ataxia cerebelosa, mientras que otros presentan características más complejas. La mutación para SCA10 es una repetición pentanucleótica ATTCT muy grande en el intron 9 del gen E46. Hay una correlación inversa entre la medida de la repetición y la edad de comienzo. Todavía desconocemos cómo esta expansión conduce a la enfermedad, pero estamos trabajando en células E46 y con otros genes adyacentes.